中华传染病杂志 1999年第1期第17卷 综述

作者：秦山　赵连三

单位：610041　成都，华西医科大学附一院病毒性肝炎研究室

　　一、基因工程核酸疫苗的概念

　　疫苗通过对易感人群接种引起特异性免疫应答来预防传染病。现有疫苗主要包括传统的灭活疫苗、减毒活疫苗以及八十年代以来兴起的基因工程多肽疫苗。它们的广泛使用对控制传染病的流行发挥了重大作用，但其缺点和不足也逐渐显露：灭活疫苗因在灭活过程中抗原性减弱或某些表位丢失而效价不理想，需要反复接种；减毒活疫苗在减毒程度不足或回复突变导致毒力增加时，存在对免疫抑制人群甚至正常人群引起临床感染的潜在危险；基因工程多肽疫苗的制备费用高，抗原性较弱，仍需重复接种^［1］。人们迫切希望研制出一类安全、有效、廉价的新一代疫苗。

　　1990年，Wolff等^［2］偶然发现给小鼠肌内注射外源性重组质粒后，质粒被摄取并表达所编码蛋白；1992年，Tang等^［3］给小鼠肌内注射质粒后，小鼠产生了针对质粒编码抗原的抗体。受此启发，不同的学者均用类似的方法使实验动物获得了对某种抗原的特异性免疫反应^［4-7］，该方法被称作核酸免疫，或基因免疫、DNA免疫、质粒裸DNA免疫等。1994年在日内瓦召开的核酸免疫研究协作会议上，专家们认为，由于质粒导入宿主细胞后并未引起宿主细胞基因组份的变化，不宜使用“基因疫苗”等概念，建议将这类方法称为“核酸免疫”，相应的疫苗则称为“核酸疫苗”。鉴于它系采用基因工程技术制备，笔者建议其命名全称应为“基因工程核酸疫苗”。其疫苗的基本成份是核酸，有别于通常的基因工程多肽疫苗。

　　二、核酸疫苗的作用机制

　　核酸疫苗不仅能激活体液免疫，而且能激活细胞免疫，产生较强的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。Ulmer等^［8］用编码流感病毒的表达质粒肌注射小鼠后，小鼠产生了特异性的抗流感病毒核蛋白抗体和CTL，且能抵抗流感病毒的攻击；对照组直接用上述核蛋白抗原免疫小鼠，尽管产生了相当水平的抗体，却不能抵抗与实验组相同剂量的流感病毒的攻击，提示核酸疫苗诱导的CTL在免疫保护上发挥了重要作用，此为核酸疫苗优于传统多肽疫苗之处。

　　三、核酸免疫的方法和途径

　　Fynan等^［9］系统地比较了不同途径(包括静脉注射、肌内注射、滴鼻、皮内注射和皮下注射等)接种核酸疫苗后的免疫保护效果，认为肌内注射效果最好。

　　Wells等人观察到生长迅速的肌肉(如幼年小鼠)有助于外源质粒的摄取和表达，雌雄小鼠对外源基因的表达有明显差别；Ulmer的研究中，雌雄鼠间却未呈现出这种差别，且一年以上的壮年小鼠在肌注质粒后也产生了保护性免疫。不过，有人认为，倘采用有助于提高质粒摄取率的措施，例如给免疫动物预先在肌内注射部位注射丁哌卡因或心肌毒素，造成局部组织变性后再生，可使质粒对肌细胞的转染能力提高十倍以上，进而使目的基因的表达明显增强^［1］，但此法恐难以应用于人体。表皮组织富含抗原提呈细胞，但表皮中各类细胞对质粒的摄取能力较差，倘应用基因枪技术^［3］则有助于对表皮中各类细胞进行有效的转染，诱导出高滴度的目的抗体。

　　四、核酸免疫在传染病防治研究中的应用

　　核酸免疫的研究触发了第三次疫苗革命。国内外学者已将它用于乙型肝炎、流感、结核病、疟疾、单纯疱疹、丙型肝炎、AIDS、尘螨所致疾病、莱姆病、淋巴脉络丛脑炎、乳头瘤病毒、狂犬病、血吸虫病、戊型肝炎等的实验研究并取得了可喜的成果，见表1。

表1　部分核酸疫苗一览

　　Davis等^［20］用HBsAg的表达质粒pCMV-S免疫小鼠后，在血中检出了HBsAg，免疫后2周达高峰，浓度达1ng/ml，此后血中HBsAg浓度逐渐下降；同时，血中抗-HBs开始出现且滴度逐渐上升，升，至免疫后2月达到平台期且能持续1年以上。Michel等^［21］用pCMV-MS免疫小鼠1周后，血中检出了IgM型抗HBs，随后出现了IgM/IgG转换，且抗preS2先于抗HBs阳转，这些都与HBV自然感染所诱导的抗体反应应答规律相类似。通过对肌注部位组织的连续病理观察发现：注射pCMV-S质粒5天后，肌细胞就开始表达HBsAg，同时有巨噬细胞、CD4⁺及CD8⁺细胞的聚集。Whalen等^［22］认为CD8⁺细胞可能就是HBsAg特异的CTL，因为在CD8⁺细胞聚集后1～2周，该局部含HBsAg的肌细胞就出现变性、损伤等变化，在质粒注射1月后，变化的肌细胞又自行恢复如常。

　　肌内注射HBsAg表达质粒似能打破表达HBsAg的转基因小鼠对HBsAg的免疫耐受^［23］。尽管这类转基因小鼠血中有高达1μg/ml的循环HBsAg，然肌注上述质粒后，肝脏中编码HBsAg的mRNA滴度明显下降，血中HBsAg滴度降低，抗-HBs也阳转。虽其机制尚不明了，但提示针对HBsAg的核酸疫苗有可能用于治疗慢性HBsAg携带患者。

　　Nebel等^［24］用质粒进行瘤体内注射，发现瘤体内也有相应抗原表达。亦提示了核酸疫苗最终用于恶性肿瘤治疗的可能性。

　　五、问题和展望

　　核酸疫苗技术已成为生物技术领域的一个热点，研究进展日新月异。美国FDA已批准近期将核酸疫苗用于AIDS患者的临床研究。目前需要解决的问题之一是如何改进提高其免疫应答的效果，核酸疫苗质粒的结构是影响免疫效果的关键因素。Xiang等^［10］比较了SV40早期启动子和CMV启动子所诱导HIV抗体的滴度，发现后者更高。近年研究发现：在众多的真核细胞启动子中(包括RSV、CMV、SV40、人肌动蛋白启动子以及脂酸结合蛋白启动子等)，以RSV及CMV启动子用于核酸疫苗的效果最好。

　　核酸疫苗将外源DNA导入人体，安全问题不容忽视，目前认为涉及以下几个方面。

　　(一) 注入质粒的转归　肌内注射质粒后，仅有很少部分被肌细胞所摄取^［6］，肌注后，反复用PCR查血中质粒，结果仍为阴性^［9］，提示肌注后逸入血流的疫苗质粒数量是微不足道的，但其余质粒去向如何尚有待进一步阐明。

　　(二) 质粒潜在的与宿主染色体整合可能性　Whalen等^［22］认为：通常实验用于核酸免疫的剂量(100μg质粒)相当于10¹³拷贝数，在注入肌肉后，绝大部分被降解和清除，质粒几无整合的可能，但此问题仍待进一步研究澄清。Nichols等^［25］用PCR法检测了核酸免疫小鼠的多种组织，未发现有质粒的整合。

　　(三) 质粒复制的可能性　核酸疫苗表达质粒不含真核复制子，不会在真核细胞内复制。当然，这需要更多的实验观察来确证。

　　(四) 抗DNA抗体　核酸的免疫原性很低。目前尚未见核酸疫苗诱导抗DNA抗体或者诱发自身免疫性疾病的报道。在Xiang等^［10］的核酸疫苗实验中，似显示不会诱导出抗DNA抗体。

　　(五) 质粒的长期过度表达　质粒长期过高水平表达，可能导致机体对该抗原的免疫麻痹或耐受。现有资料尚未发现这种情况，但进入体内的质粒能表达多久、能达到多大的表达强度以及何种状态最为适宜等，均有待进一步研究。

参考文献

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本文关键字：传染病,核酸免疫,DNA