分枝杆菌的分子生物学诊断进展

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分枝杆菌的分子生物学诊断进展

作者：张晓兵文章来源：中华检验网点击数：更新时间：2005-9-27 0:39:12

张晓兵（重庆市西南医院检验科，重庆400038）

摘要：由于分枝杆菌生长较缓慢，其分离、鉴定和药敏实验通常要几周或更长时间，因此其快速诊断显得很重要，分子生物学的发展为其提供可能。目前用于分枝杆菌诊断的核酸扩增技术有Amplicor和E-MTD；PCR测序对分枝杆菌的鉴定是最常用的；DNA探针也得到广泛的应用；基因芯片可以同时对多种分枝杆菌鉴定且可检测药物耐受相关的基因突变。
关键词 分枝杆菌；分子生物学

分枝杆菌属由结核杆菌菌群和80多种非结核杆菌组成，其中最重要的细菌是结核杆菌。结核病是一种严重的传染病，在世界范围内每年大概有200多万人死于该病，而且每年又有800多万人感染该病（1）。鸟分枝杆菌也是临床常见的非结核分枝杆菌，由其引起的感染也非常具有临床意义，又尤其AIDS患者（2）。结核杆菌和其他分枝杆菌感染最大的区别在于结核能够在人与人之间传播，另外抗生素的治疗也是根据分枝杆菌的不同而定，因此分枝杆菌的快速诊断就相当重要的。
最初分枝杆菌感染的诊断是依据临床特点，具有决定性的诊断是依靠实验室从感染标本中培养、分离和鉴定的结果。由于分枝杆菌生长特别缓慢，要花数周的时间才能得到结果。
近年来分子生物学技术的迅猛发展，这为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从几周降低到几天。本文就可用于分枝杆菌的分子学诊断方法作简单综述。

    1. 直接检测分枝杆菌

许多分枝杆菌包括结核杆菌由于生长相当缓慢，在传统的固体培养基上培养需要3-8周，导致结核病诊断的延误。而核酸扩增技术（Nucleic acid amplification NAA）能够直接检测分枝杆菌的DNA或RNA。用于临床分枝杆菌检测的NAA主要有两种：E-MTD（Enhanced Mycobacterium tuberculosis Diret al Test）和Amplicor(Amplicor Mycobacterium tuberculosis Test)。

    1.1 Amplicor

Amplicor是基于PCR原理的一种核酸扩增技术。具体是利用分枝杆菌的16S rRNA构建属特异性引物，利用该引物扩增分枝杆菌的DNA，然后将扩增子变性形成的单链滴定到含有结核杆菌特异的寡核杆酸探针的微量滴定平板上，于是含有辣根过氧化物酶的结合物就和生物素标记的扩增子结合，引发结合物和过氧化物以及四甲基联苯胺在二甲基甲酰胺中的反应，形成有颜色的复合物，用光密度计就可以测其结果。由污染而造成的假阳性可用掺入含N端结合糖基化酶的尿嘧啶的dUTP而消除。用含N-乙酰-L-半胱氨酸的NaOH将标本降解后，该方法仅需6.5h就得到结果，且易于自动化。
    呼吸道标本，Amplicor法较培养法其敏感性为79.4-91.9%，特异性为99.6-99.8%，阳性预测值为92.6-96.6%，阴性预测值为98.6-98.7%。但是，对于涂片结果为阴性的标本，Amplicor法的敏感性很低，为40.0-73.1%（3,4）。因此，FDA规定Amplicor法仅用于抗酸染色(AFB)阳性的呼吸道标本结核杆菌的直接检测。有文献报道（5），临床诊断为结核病的患者的呼吸道标本用Amplicor法检测结核杆菌的敏感性与传统的培养方法的敏感性相似（58% vs 56%）。又有文献报道（6），虽然Amplicor法的特异性为100%，但对于活动性极低的肺结核患者（这种患者怀疑为结核病，但却不自发出现痰液或抗酸染色为阴性）的诊断其敏感性却比培养法低（42% vs 73%）。

    1.2 E-MTD

E-MTD是根据转录介导扩增原理发展而成的技术。具体是用超声降解靶细胞，使其释放rRNA，将启动子引物结合到靶rRNA上，然后利用反转录将rRNA拷贝成cDNA-RNA的杂交体，RNA链被降解后，又一引物结合到cDNA链上进行扩增，这样就形成双链cDNA，双链cDNA依靠DNA依赖的RNA聚合酶转录成rRNA分子，又以新的转录子为模板通过反转录和扩增形成更多的rRNA。通过液相杂交分析，RNA扩增子就能被吖啶酯标记的DNA探针检测。注意的是扩展产物要求恒温而且反应在同一试管内进行，这样有利于降低污染。临床标本经过去污染处理后，E-MTD法需3.5h就完成。
    E-MTD法对于抗酸染色阳性和阴性的标本都行。对于呼吸道标本该法较培育法其敏感性为90.9-95.2%，特异性为98.8-100%，阳性预测值为83.3-100%，阴性预测值为98.4-99.6%（7-9）。文献报道该方法最适合于临床中度怀疑结核的检测（10）。因此FDA规定E-MTD法既适用于AFB阳性标本也适用于AFB阴性标本。
有文献（11）比较E-MTD和Amplicor的特性：用这两种方法对486份呼吸道和非呼吸道标本进行分枝杆菌测定，结果两者没有显著性差异。值得注意的是虽然E-MTD较Amplicor快，但Amplicor可自动化而且可通过监测扩增抑制剂而进行内部控制。

    2培养后分枝杆菌的鉴定

分枝杆菌种的鉴定常根据培养特征和一系列的生化反应来确定。由于分枝杆菌的生化反应经常发生变化，这为其鉴定带来了不确定性。又由于生化反应慢、麻烦且易带来模棱两可的结果，因而分子学方法的运用就显得相当重要。

    2.1 DNA探针技术

DNA探针技术运用于临床重要的分枝杆菌如鸟分枝杆菌、细胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌群、堪萨斯分枝杆菌和戈氏分枝杆菌等的鉴定已有一段时间。其原理是：提取细菌的rRNA与具有种特异性的用吖啶酯标记的DNA探针进行杂交，结果通过发光计就可以得到。培养后，鉴定到种仅需2h。由于方法简单、快速、敏感、特异性强且不需要特殊的设备，临床已得到广泛应用。如DNA探针结合到BACTEC或其它液体培养系统可缩短分枝杆菌的鉴定时间，但该法不能用于所有致病分枝杆菌的鉴定。

    2.2PCR测序

PCR测序是分枝杆菌鉴定的金标准。用属特异性引物PCR扩增分枝杆菌DNA，然后测扩增子的序列，与参考序列相比较就可得到鉴定结果。仅需一个测序反应就可得到确定的结果。有许多分枝杆菌就是用该法而得到确定（12）。
    目前常用的靶基因是由16S rRNA拷贝而成，该基因分恒定区和可变区，对于细菌分类是理想的靶基因。16S rRNA是从许多分枝杆菌测序而得到的，基于该基因的鉴定法在临床实验室得到广泛的评价。16S rRNA两个超变区为大多数分枝杆菌的鉴定提供了可能。但是，该法不能对结核分枝杆菌鉴定到型。注意的是，堪萨斯分枝杆菌这一重要的病原体与无致病性的胃分枝杆菌16S rRNA有相同的序列；对于海水分枝杆菌与溃疡分枝杆菌的区别还需要测16S rRNA其它区（13）。基于该目的，还有些基因可作为靶基因，如编码32-kDa的蛋白、65-kDa的热休克蛋白及16S-23SrRNA间的转录间隔序列（14），这些基因序列的多样性为临床对除结核分枝杆菌群外的分枝杆菌的鉴定提供了可能，这也为堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌的区分提供可能。由于编码65-kDa热休克蛋白基因在种群间存在多样性，因此可用于一些分枝杆菌的鉴定（15）。

    2.3 DNA微阵列分析

DNA微阵列分析又叫高密度寡核苷酸分析法，一步杂交就可快速地检测大量的DNA序列。该方法可用于分枝杆菌属多菌种的同时检测，而且还可对利福平耐受的突变基因的检测。从菌落中提取DNA用PCR进行扩增，扩增产物用荧光标记后进行杂交，结合的扩增子所发出的荧光用扫描仪就可以检测出。该方法所用的探针是从82种独特的16S rRNA序列得到的，可以分辨出54种分枝杆菌和包括独特的rpoB基因突变在内的51种序列。最近用该法鉴定70株分离标本中的67株，由于探针序列的错误而导致所有3株M.szulgai被鉴定为M.malmoense.如果分枝杆菌培养阳性，用该法鉴定到种仅需4h(16-17)。
    分枝杆菌的鉴定，分子学较传统方法有很大的好处：检测快速而且结果可靠，重复性好，即使培养混杂或被污染，仍然可以用该法鉴定。对于普通的分枝杆菌鉴定所需的探针已广泛运用。PCR测序法现已被许多分枝杆菌参考实验室作为常规方法对其菌种进行鉴定。DNA微阵列分析有很大的潜力，简单，易于自动化，一次可鉴定多种分枝杆菌。

    3 耐药突变的检测

仅几种药物对治疗结核病有效，如出现耐药，结核病的控制就相当棘手。位于结核杆菌染色体上的基因位点随机发生抗生素选择性突变而导致耐药，这一过程没有质粒或可换位因子（指基因水平的转录）的参与。核苷酸的变化（如点突变）只能是单一药物的耐受，这种突变逐步积累就可导致结核杆菌的多重耐药。当药物治疗断断续续或没有多大疗效时，结核杆菌药物耐受株就会出现。
结核杆菌培养出来，在固体培养基上作药敏实验要花2—4周以上才能得到结果，分子生物学法能对与耐药有关的基因突变快速检测。因为结核杆菌对利福平的耐受很有特点且简单，对其他药物的耐受的分子基础相当复杂，目前主要对利福平耐受的检测，其耐受可作为结核杆菌多重耐受的标志。

    3.1 PCR测序

PCR测序是阐明分枝杆菌耐药遗传机制的主要方法。对于过去认识和没认识的突变的检测，该法是最直接和可靠的。但是PCR测序对药物耐受突变的分析不能象该法用于分枝杆菌种的鉴定那样作为常规方法，因为药物耐受可能有多种基因有关，如对异烟肼的耐受就与多基因突变有关，或基因突变可在基因的一大段上扩散。这就要求每株分离菌的药敏实验要进行多个测序反应。然而，与利福平耐受相关的rpoB基因一样的标记基因，由于只是在基因的一小段发生突变，因此PCR测序对其突变分析为一有用的技术（15）。

    3.2 线探针技术

线探针技术已用于对利福平耐受的快速检测。其原理是据反义杂交技术，将rpoB基因通过PCR法扩增，变性后将PCR扩增子用生物素标记，然后与结合在硝化纤维条上的探针进行杂交，与结合有链亲合素的碱性磷酸酶和BCIP/NBT铬酸反应产生颜色而检测出扩增子。该法所用的硝化纤维条含有5个rpoB基因原始序列的探针和4个特异的rpoB突变序列的探针，另外还含有结合物和结核杆菌的质控探针。该法可以对结核杆菌群进行鉴定和对rpoB突变进行检测。该法可以对培养得到的结核杆菌或对标本进行直接检测。该法所花时间为48h。据报道该法与培养后的直接药敏实验和直接测序的一致性非常好，大约为92.2-99.0%（19-20）。尽管本法只能对rpoB的35种不同突变中的4种突变进行检测，但临床上75%以上的对利福平耐受的结核杆菌均只发生4种突变中的1种（18），因此该法对利福平耐受的快速检测是很有用的，对其它少见的突变该法则不能进行检测。

    3.3 DNA微阵列分析

前面介绍的对鉴定分枝杆菌的微阵列分析法也可用于与抗结核药物耐受有关的突变的基因的快速检测。有人用DNA微阵列和测序法分析了44例对利福平耐受的结核杆菌的rpoB基因，结果有40例为过去所见的突变，1例为新的突变，剩下的3例根本就没有发生突变（16）。这可能属于大约4%的对利福平耐受机制不明的范畴。又有人用DNA微阵列分析了15例对利福平耐受和1例对利福平敏感的结核杆菌的rpoB基因，发现15例耐受者rpoB基因均发生突变。突变有单一的或成对的碱基被取代，或三、六碱基缺失，也发现了1例过去所没有认识的突变，这些结果与基因测序分析相吻合（17）。现可用DNA微阵列分析法对多种药物耐受的遗传因素进行同时检测，包括katG、inhA、rpoB、rpsL和gyrA（与氟喹诺酮耐受有关）基因序列的分析（16）。该法很可能为结核杆菌药物耐受相关的基因突变分析的快速、有效的检测方法。
由于对结核杆菌耐药的遗传机制还不完全清楚，临床用分子学的方法进行药敏实验的缺点就在于此。虽然用该法对耐受相关突变的检测与临床有一定的关系，但目的基因没有突变发生是否就认为生物体对药物就敏感，这还不明确。目前，分子学的方法可对药物耐受的相关突变进行快速检测，其实验结果还要通过表型法确定。

本文关键字：分枝杆菌,结核杆菌,分子生物学

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