快速培养在结核病细菌学诊断中的应用
王苏民 付育红 李云絮 赵丽平 毕志强
卫生部结核病控制中心

　　近年来全球结核病疫情的回升已经引起了人们的强烈注意。而人口的增加、AIDS合并结核病、耐药结核病和移民是引起结核病疫情回升的四个重要原因。严重地危害了广大人民的健康水平。结核病当今全球范围最具有临床意义的感染性疾病之一，是单因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病，是一个严重的公共卫生问题。WHO1993年宣布"全球结核病紧急状态"，号召全世界动员起来"主动制止结核病"。

一、我国结核病疫情的严重性
　　我国属于全球结核病高负担国家之一。结核病的患病人数在世界各国中居于第二位。结核病是危害人民健康的重要传染病之一。我国的结核病疫情呈三高一低，即患病率高、死亡率高、耐药率高、年递降率低。估计全国有肺结核病患者600余万人，75%的病人年龄在15-54岁之间结核病成为当前农村中因病致贫，因病返贫的主要传染病。
二、结核病细菌学检查现状
　　 结核病人的细菌学检查,是发现传染源的主要途径和手段,是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据,也是考核疗效，评价治疗效果的可靠标准，是国家结核病控制规划（NTP）的重要组成部分。在结核病防治工作中起着不可缺少的重要作用。但常用的细菌学检查方法尚存在着灵敏度低，操作复杂，须时间较长和影响因素较多等问题。因此，发展特异，敏感，早期，快速，简便和预测预后的结核病细菌学检查方法是大家共同期盼的。
三、常用的细菌学检查方法
　　 1、痰涂片镜检法：特点：快速，当天出结果，但不分死菌活菌，敏感性低，需5000-10000条菌/ml,特异性差，各种抗酸杆菌均可着色。
　　 2、痰结核菌常规培养法；特点：时间长，2-8周，但可分死菌活菌，敏感性低，涂片阳性标本只有约80%培养阳性特异性差，各种分支杆菌均可生长，须结合药物敏感性实验和分支杆菌菌种鉴定须时更长。
　　 3、药物敏感性实验：用于鉴定结核分支杆菌对抗结核药物的敏感性水平。
　　 4、分支杆菌菌种鉴定：用于鉴定分支杆菌菌种。
四、痰结核菌常快速养系统：
　　由于分枝杆菌的遗传特性决定的生长周期长、致使常规细菌学检查方法检出率低、不易标准化等原因，使细菌学诊断发展缓慢，无法充分满足临床诊断的需要。20世纪70年代发展了的一种新的结核病细菌学检查方法---痰结核菌常快速养，这一方法具有操作简单，自动化强，灵敏，快速等优点。促进了结核病细菌学诊断学的发展。最早使用的仪器是美国BD公司研制生产的全自动分枝杆菌检测系统BACTEC?460TB。这一系统多年来在结核病的细菌学诊断中起到了重要作用,但是由于采用了放射性同位素, 存在放射性污染问题。BD公司于1998年又研制推出了大容量、安全、快速、全自动分枝杆菌培养、检测、药敏系统-BACTEC? MGIT? 960系统。采用连续荧光探测法，避免了放射性元素对环境的污染。
1、 工作原理：
　　1） BACTEC?460TB系统检测原理：是测定分枝杆菌的代谢产物，在Middlebrook? 7H12培养瓶中加入含有放射性14C棕榈酸底物，当检测标本经处理接种于含杂菌抑制剂NAP的培养瓶内，如有分枝杆菌存在，分枝杆菌代谢时将酶解培养瓶中标记14C棕榈酸基底物，使其脱羧产生带有放射性的14CO2，BACTEC?460TB将培养瓶中14CO2送入电离室，并自动显示测定结果，以生长指数GI（GROWTH INDEX）表示，如生长指数升高达到一定程度报告阳性结果。
　　 2） BACTEC? MGIT? 960系统工作原理：使用BBL? MGIT?分枝杆菌快速培养管。在MGIT? Middlebrook?7H9培养基底部硅酮树脂内埋置对氧分子浓度极为敏感的荧光指示剂，若培养管内接种的标本中有分枝杆菌生长，培养管内的氧气将被消耗，管底的荧光指示剂将在内置紫外激发光的照射下发出荧光，荧光强度变化直接反映培养管内分枝杆菌生长状态。BACTEC MGIT 960荧光强度记忆探测器将每隔60分钟连续自动测定培养管内荧光强度的变化，经过计算机处理系统分析从而判断管内分枝杆菌的生长情况。
2、BACTEC? MGIT? 960系统操作步骤：
　　1）将待检样本用等量N-乙酰-半胱氨酸-4%NAOH混合液去污染消化处理，离心待用。
　　 2）在MGIT管标签上直接标记
　　 3）旋开MGIT管盖，在无菌条件下用滴管加入0.8mlOADC与PANTA混合液
　　 4）加入0.5ml处理好的标本（注意：标本量超过0.5ml会增加污染机会）
　　 5）旋紧管盖，适当混匀
　　 6）拉开BACTEC MGIT 960的抽屉，按下放入标本键，此时条形码扫描器会自动开启，将标本管靠近条形码扫描器，轻轻转动，将标本管放入闪绿色LED灯的位置，关上抽屉，仪器自动检测。
3、卫生部结核病控制中心于2000年购进了BACTEC? MGIT? 960系统并与原有的BACTEC?460TB系统进行了初步的比较。结果如下：
　　 1）为了对BACTEC?460TB与BACTEC? MGIT? 960及改良罗氏培养系统进行比较，我们收集了105份临床标本，其中结核病例82份，其他肺部疾病23例。在82份结核病病例中，960阳性25份，460阳性17份。其它肺部疾病23例均为阴性。结果见表1：
　　　　　　　　　　表1：BACTEC? MGIT? 960与BACTEC?460TB
　　　　　　　　样本数 　　总阳性率 　　涂阳培阳（%）　　 涂阳培阴（%）　　涂阴培阳（%）
　　　BACTEC960　　 82 　　　30.5% 　　　19 （86.4） 　　　　3 （13.6）　　　 6 （10.0）
　　　BACTEC460 　　82 　　　20.7% 　　　13 （59.1）　　　　 7 （31.8） 　　　4 （6.7）
　　从上表中可以看出，BACTEC? MGIT?960的培养阳性率（30.5%）高于BACTEC?460TB（20.7%），阳性率有所增加。
　　 2）、我们对BACTEC? MGIT? 960与BACTEC?460TB的阳性报告时间进行了比较，结果见表2。
　　　　　　　　 表2：BACTEC? MGIT? 960与BACTEC?460TB的阳性报告时间的比较
　　阳性报告时间（天） 3 　4 　5 　6 　7 　8 　9　 10 　11 　12 　13 　14 　15 　16
　　BACTEC 960系统 　　16 　　4 　　　　5
　　BACTEC 460系统 　　1 　1 　　　3　 2　 2 　4 　　　　1 　2 　　　　　　　　　1
　　从表2的结果可以看出BACTEC? MGIT? 960系统较BACTEC?460TB系统的阳性报告时间有明显的减少。BACTEC? MGIT? 960系统报出阳性结果的比例3天为64%，5天为80%，7天为100%；BACTEC?460TB系统报出阳性结果的比例3天为4%，7天为28%，11天为88%。
　　 3）我们也集中收集了26份临床结核病例，同时用BACTEC960，BACTEC 460与罗氏培养作比较，BACTEC960阳性12例，BACTEC 460阳性5例，罗氏培养阳性12例，比较表3：
　　　　　　　　　　　 表3：BACTEC? MGIT? 960与罗氏培养的比较
　　　　　　　样本数 总阳性率 　涂阳培阳（%） 　涂阳培阴（%）　涂阴培阳（%）
　　BACTEC960　 26 　30.8%　　　 8（100.0） 　　　1 （12.5） 　　　3（16.6）
　　BACTEC460 　26 　19.2% 　　　5（100.0）
　　 罗氏培养　 26 　30.8% 　　　8（100.0）　　　 1 （12.5） 　　　3（16.6）
　　从表3可以看出，BACTEC960，BACTEC460与罗氏培养的结果大致相似。但由于研究的例数太少，尚无法得出更多的结论。
五、结论：
　　结核病细菌学快速检测方法已经有了20多年的历史，在世界上多个国家得到广泛的应用，取得了良好的效果。仪器检测标本的种类广泛可包括：痰、胸腹水、体液、脑脊液、组织块等非血液标本。与常规培养相比，自动化强，减少了烦琐的人工劳动；阳性报告时间较常规培养明显缩短；且可以动态检测。在结核病控制工作中发挥了重要作用。特别是BACTEC MGIT 960问世以后克服了BACTEC 460 TB的不足之处使这一技术进一步完善。BACTEC MGIT 960与BACTEC 460 TB具有以下的优点：
　　1. 无放射性污染，由此可省去相关的步骤和废弃物的处理，节省了实验室空间，保护了工作人员免受放射性元素污染。
　　 2. 系统提供由微电脑控制的培养箱，提供分枝杆菌生长需要的最佳环境。
　　 3. 系统内置计算机，采用图形界面，简单易懂，可自动存储数据，支持多机相连。
　　 4. 内置条形码扫描器、软盘驱动器、各种指示灯，工作人员的各步操作一目了然，方便快捷。
　　 5. 采用抽屉式培养箱放置标本，每个抽屉内有320个瓶位，一共有960个瓶位，每年可处理8000份标本，适用于各级实验室的检测需求。
　　 6. 系统24小时连续检测，每小时自动测定一次培养管的荧光强度变化，利于快速早期发现分枝杆菌生长情况，使阳性标本检出时间缩短至3-6天。并且系统内置实验标准管，每小时自动进行一次质控，自动化程度高。
　　 为了适合样本量小的用户的需求，BD公司还推出了BBL? MGIT?手工荧光判读器，工作原理、实验步骤、使用的耗材与BACTEC? MGIT? 960相同的，它可以直接判断培养结果，内含定标管，操作简单快捷。由于其设计精巧，便于携带，使其更适合异地考察，进行流行病学调查等工作的需要。

本文关键字：结核防治,肺结核,结核